計數(shù)法的檢驗

計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的**、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。

1.平皿法

常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法都是平皿法。供試液通過離心沉淀以后也可用平皿法檢查。

采用平皿法進行菌數(shù)測定時，應(yīng)取適宜的連續(xù)2~3個稀釋級的供試液。取供試液1ml，置直徑 90mm 的無菌平皿中（培養(yǎng)基稀釋法，則將 1ml供試液均勻分注入2個或以上的平皿中），注入15~20ml溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混人，凝固。倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。

陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液 lml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。

培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外，**培養(yǎng) 48 小時，逐日點計菌落數(shù)，一般以 48小時的菌落數(shù)報告∶霉菌、酵母菌培養(yǎng) 72.小時，逐日點計菌落數(shù)，般以72 小時的菌落數(shù)報告;必要時，可適當延長培養(yǎng)時間至5~7天進行菌落汁數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于 15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。

一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用士**計數(shù)∶ 改瑰紅鋼瓊脂培養(yǎng)基用干霉菌及酵母菌計數(shù);酵母浸出粉胨陳葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用干酵母菌計數(shù)。在特殊情況下， 若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有**，則應(yīng)分別點汁霉菌和酵母菌、**菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的**數(shù)，與玫現(xiàn)紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和整母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的**數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。

 含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。

菌數(shù)報告規(guī)則 宜選取**、酵母菌平均菌落數(shù)在 30～300 之間、霉菌平均菌落數(shù)在 30～100 之間的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。

（1）當僅有1個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

（2）當同時有 2個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時，視兩者比值（比值為高稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值）而定。若比值不大于2，以兩稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報告菌數(shù);若比值大于2但不超過5時，以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù);當出現(xiàn)比值大于5，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時，應(yīng)查明原因再行檢查，稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時，應(yīng)進行方法的重新驗證。

（3）當各稀釋級的平均菌落數(shù)均小于 30，以*低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

（4）如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅*低稀釋級的平板有菌落生長，

但平均菌落數(shù)小于1時，以<1乘以*低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

薄膜過濾法

采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約為 50mm。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法**。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的*大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。

操作步驟

取相當于每張濾膜含 1g 或lml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每 1g 或 Iml 所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液 lml，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同"計數(shù)方法的驗證"。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。

陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液lml照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過 100 個。

菌數(shù)報告規(guī)則 以相當于1g 或 lml供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù);若濾膜上無菌落生長，以＜1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g或1ml供試品），或＜1乘以*低稀釋倍數(shù)的值報告